混合斑怎么提取精虫做DNA亲子鉴定（精虫亲子鉴定）

    1、接到案件检材后，首先肉眼观察可疑斑痕，剪取少量斑痕置于载玻片上加一滴蒸馏水浸泡，并放于保湿盒内10分钟，充分使斑痕浸泡出来，干燥，甲醇固定，用酸性品红亚甲兰染色镜检，并确定有精虫。

    用两步法提取精虫DNA.分别剪取适量检材斑痕，用3mlTES浸泡10分钟，加300μlSDS及30μl PK,充分混匀后放入37℃水浴中孵浴90分钟，在***步消化女性成分中，中间补加20μl PK,并每间隔15分钟混匀30秒。3500转离心10分钟，上清备用，沉渣再用蒸馏水洗涤3次，沉渣涂片镜检观察有精虫，用三种方法分别抽提DNA.

    2.取100μl沉渣于1.5ml管中，加400μl TES,50μl SDS及12μl PK和30μl DTT,置于37℃水浴中过夜，依次用等体积的饱和酚、等体积的1:1酚/氯仿，等体积的氯仿抽提，水相中加入2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并置于-20℃冰箱中20分钟，离心去上清，用滤纸小心吸去残留在管壁的水分，加30μl去离子水充分混匀后置于100℃水浴中30分钟，即可进行PCR扩增检测。

    3.取100μl沉渣置于1.5ml管中，加200μl Chelex-100,12μl PK及30μl的DTT,充分混匀后置于100℃水浴中30分钟，12000转离心后，取上清进行PCR扩增检测。

    4.三种方法抽提的DNA与受害人、嫌疑人血样DNA一起同步扩增检测。PCR反应体系在20ul体系中进行。PCR缓冲液为50mmol/L KCL、10mmol/L Tris-Hcl、1.5mmol/L Mgcl、200mol/L dNTP,每组分别加0.5ulDNA,用本实验室自己合成的CSF1PO等14对引物进行检测，置于扩增仪中95℃4分钟后88℃条件下加入1u的DNA聚合酶，95℃15秒，60℃15秒，72℃45秒，循环14次，在90℃15秒，60℃15秒，72℃45秒循环16次，95℃5分钟后备检。

    5.聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳90分钟，AgNO3染色，碳酸钠显色。有机法提取DNA过程中，利用DNA只溶于水，而难溶于有机溶剂这一特性，用有机溶剂进行萃取，清除检材中脂类、色素、染料等，并使蛋白质（酶类）变性，使DNA得以浓缩纯化，但其有不能有效地祛除金属离子对扩增的影响及步骤繁琐，污染机会多，DNA损失等缺点；

    5%的Chelex-100法，是利用Chelex-100具有较强的金属离子亲和力，能彻底地螯和金属离子，清除金属离子对扩增的抑制，并防止DNA的降解，而且方法简便快捷，并在100℃煮沸30分钟的条件下使精虫细胞膜得以破裂，精虫DNA得到有效释放，其缺点是检材中的高浓度金属离子、色素、染料、脂类、蛋白质等成分不能清除，DNA未得到浓缩。

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